技术开发

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随着人们生活节奏的加快和饮食结构的变化，罹患癌症的人群增多，对癌症的前期诊断和术后的监控尤为重要。前期研究发现miR-196a-5p和miR-125a-5p在肺癌发生发展中起重要作用，它们的表达水平被应用于临床检验，有望成为肺癌早期诊断及区分肺癌不同分期的客观指标。基于海胆状金纳米粒子的表面增强拉曼散射技术（SERS）和侧向层析分析技术（GICA）的各自特点，我们通过结合 SERS 和侧向层析技术来建立一种新型的miRNA 检测方法-SERS-GICA 技术。该方法充分发挥了 SERS 和 GICA 各自的优势，利用海胆状金纳米粒子的SERS技术可实现对病例样本中目标 miRNA 的高灵敏、定量化检测，减少主观因素的影响，有利于监测病人病情变化及治疗情况。GICA中硝酸纤维（NC）膜不仅成本低、易操作、简便、快捷，而且SERS标记探针高度集中在约 150 m 宽的检测线（T 线），可采集到更为均匀的信号。本课题研究开展的重点工作，主要是：（1）基于海胆状金纳米粒子和金纳米多巴胺树脂（PDR@GNPs）复合微球构建“三明治”结构SERS传感器，对水溶液中 miR-196a-5p进行定量检测。（2）制备多线多重SERS-GICA核酸试纸条，将其用于检测皮下异种肿瘤移植的小鼠肺癌发生发展阶段外周血中miR-196a-5p和miR-125a-5p的表达变化。（3）为了进一步鉴定这两种miRNA作为肺癌标志物的潜力，基于多线多重SERS-GICA核酸试纸条检测miR-196a-5p和 miR-125a-5p在肺癌患者和健康人外周血、 尿液和痰液中的表达水平。 研究这两种miRNA 在不同分期肺癌患者外周血、 尿液和痰液中表达情况，并分析两者之间的相关性。（4）建立SERS-GICA单线多重检测miRNA的方法，实现单线同时检测人肺癌细胞系中miR-196a-5p和miR-125a-5p的表达水平。本研究拓展了miRNA检测方法，对实现肺癌早期诊断和病情监控具有重要意义。该试纸为肺癌早期诊疗做出贡献，同时也可以为其他疾病的检测提供通用平台。

（1）在不添加表面活性剂的条件下，优化反应条件，采用种子介导生长法制备既空间不对称又具有尖锐边缘或枝角的海胆状新型金纳米结构。发展一种简单、快速、产率高制备海胆状金纳米粒子的方法。
（2）发展一种快速、灵敏、高效、低廉的检测miRNA的新方法。基于海胆状金纳米粒子构建多线多重和单线多重SERS-GICA核酸试纸条，用于miRNA-196a-5p、miRNA-125a-5p的检测。在病例样本中目标miRNA较低的情况下，充分发挥SERS技术和GICA技术各自的优势，能够将miRNA的最低检测限显著性提高，并快速和定量测得样本中miRNA的表达水平，这对实现miRNA的临床检测具有重要意义。
（3）既往对肺癌的研究多数集中于对CEA、NSE、CK-19等蛋白质类相关指标的检测，以miRNA作为肿瘤标志物更具灵敏性和特异性。直接以外周血、尿液和痰液作为生物检测样本，具有取材方便、操作步骤简单、无创伤性和可连续体外检测等优点。
（4）我们从技术上率先使用SERS-GICA技术检测外周血、尿液和痰液中miRNA-196a-5p、miRNA-125a-5p的表达水平，试图揭示这两种miRNA在推动肺癌病程进展中的作用及功能，对肺癌早期诊断、预后、病情监测和治疗具有重要意义。

（1）使用qRT-PCR法对A549细胞和BEAS-2B细胞中miRNA-196a-5p表达水平检测，结果显示，A549细胞中的miRNA-196a-5p表达水平明显高于BEAS-2B细胞（图4A）。使用qRT-PCR法对新鲜肺癌组织及癌旁组织中miRNA-196a-5p和miRNA-125a-5p表达水平检测，结果显示，肺癌组织中的miRNA-196a-5p表达水平明显高于癌旁组织（图4B），而肺癌组织中的miRNA-125a-5p表达水平明显低于癌旁组织（图4C）。
（2）通过SEM 和TEM表征了海胆状金纳米粒子的形貌和结构，如图5A和图5B所示。海胆状金纳米粒子的形貌均一、单分散性好。每个海胆状金纳米粒子粒径约70 nm，由一个50 nm的中心核及6-10个10 nm的纳米枝角构成。海胆状金纳米粒子表面的纳米枝角使得单个纳米粒子上同时具有多个“热点”，这将显著增强其SERS效应。图5C是海胆状金纳米粒子的高分辨透射电镜（HRTEM），纳米粒子表面的纳米枝角具有一致的晶格取向，因而为单晶结构。清晰的晶格条纹表明产物具有良好的结晶性和纯度，其中晶格间距d=0.24 nm对应Au的(111)晶面。选区电子衍射（SAED）图谱中明亮的衍射点也表明产物为单晶，衍射斑点的d值为0.275 nm，0.24 nm，0.144 nm和0.123 nm，分别对应于Au的(311)、(111)、(022)和(123)面的晶面（图5D）。图5E显示海胆状金纳米粒子溶液的颜色蓝绿色，LSPR吸收峰位于650 nm处。图5F是海胆状金纳米粒子作为增强基底测得的10-7 M 4-MBA的SERS光谱。计算得到的海胆状金纳米粒子的拉曼增强因子（EF）为7.5×105，远高于金纳米球的EF（0.8×104）。

（3）在滴加含有不同浓度miR-125a-5p的样品溶液后（1 mM、10 nM、1 nM、0.1 nM、10 pM、1 pM、0.1 pM、10 fM），SERS试纸检测线和质控线的显色结果如图6A所示。从光学照片可以看出，这种纳米颗粒所制作的试剂盒最低检测限均为1 nM。通过SERS特性评价实验，滴加含有不同浓度miR-125a-5p的样品溶液，待其检测线和质控线的显色干燥后，利用拉曼光谱仪采集检测线上拉曼分子的光谱，每个条带分别随机取5个不同点测量，检测结果如图6B所示。选取4-MBA分子位于1077 cm-1处的特征峰强度作为比较的标准。拉曼光谱强度随样品中miR-125a-5p浓度的增加而增强。图6C是1077 cm-1处特征峰的拉曼强度与miR-125a-5p浓度对数值的关系图。4-MBA在1077 cm−1处特征峰的拉曼强度与miR-125a-5p浓度的对数值呈现一定的线性关系，线性方程为Y=10852X+98760，线性相关系数为R=0.95。因此，我们可以利用4-MBA在1077 cm−1处的特征峰和其浓度对数值的线性关系来定量地分析检测一定浓度范围内的miR-125a-5p。基于光学或肉眼的miR-125a-5p 侧向层析检测方法的检测范围为＞1 nM，基于拉曼的miR-125a-5p侧向层析检测方法的检测范围为＞10 fM。