未申请专利

CRISPR基因编辑技术是一项能够实现靶向性的突变目标序列、对目标基因进行敲除、敲入以及修饰的重要技术，以其操作简单、经济高效的优点超越了传统技术，成为科学界的新宠，但是，简单的基因编辑已经不能够满足现代科学研究的需要，而复杂的基因编辑需求，利用CRISPR来实现的难度仍然较大。
目前，芳景生物已经建立起完备的果蝇CRISPR基因编辑服务平台，能够提供方案设计、样品制备、显微注射、转基因筛选及分子鉴定的整体技术流程方案。且芳景生物针对多种复杂高难度的基因编辑需求，如：KO表型挽救、相似度较高同源基因替换、多位点基因突变构建、多序列和复杂序列插入、FRT序列引入实现条件敲除等，将“两步法”的技术方案进行了优化，建立了一套成本更低，效率更高的“两步法”技术方案。
1）第一步，基因敲除与attP插入（如图1）：
芳景生物提升了果蝇基因编辑的基因替换效率，可高效的将基因替换为attP-3P3-RFP-loxP序列，获得带有RFP筛选标记的KO-attP果蝇。


2）第二步，在attP果蝇中插入目的序列（如图2）：
芳景生物优化了attP序列和attB载体，将带有attB、目的序列的质粒DNA，和PhiC31表达酶质粒共注射到第一步获得果蝇的胚胎中，实现了将目的序列整合到果蝇基因组的attP位点，并通过CRE重组酶将多余序列移除，最终获得由目的序列替换原序列的最终果蝇品系。
通过该技术方案，基本可以高效的实现100kb范围内任意形式的基因编辑，解决了复杂基因编辑难度较大的问题，拓展了果蝇CRISPR基因编辑更广阔的应用场景。
另外，芳景生物致力于其他昆虫物种基因编辑平台的搭建和开发，目前，芳景正在进行或者已经完成的昆虫基因编辑的物种包括：黑水虻，玉米螟，赤拟谷盗，桔小实蝇，小菜蛾，蚊子，家蚕等。

果蝇之外其他昆虫物种基因编辑的难点在于：
1）饲养条件复杂，如果方法不当，会导致昆虫生长状态较差甚至死亡；
2）基因编辑效率不确定；
3）没有工具品系，获得阳性之后，较难做成纯合品系。
针对这些技术难点，芳景生物逐一进行了攻克：
1）有专门的团队进行饲养条件的摸索和开发，建立了成熟的昆虫饲养研发平台；
2）研发了效率较高的cas9样品，并通过优化gRNA设计方案，整体提高了CRISPR基因编辑效率；
3）建立了一套完整高效的鉴定杂交方法，缩短了项目成本和项目周期，与传统的杂交方法相比，可以更加方便快速的获得纯合品系。
芳景生物希望通过基因编辑技术的经验和优势，通过对不同物种饲养方式的研发，不断开发和建立新的昆虫物种基因编辑平台，打造精准昆虫工业。